0 просмотров
Рейтинг статьи
1 звезда2 звезды3 звезды4 звезды5 звезд
Загрузка...

Нобелевская премия по химии — зачем нужна криоэлектронная микроскопия

Крупные подробности микроскопического мира: Нобелевская премия по химии 2017

05 октября 2017

Крупные подробности микроскопического мира: Нобелевская премия по химии 2017

  • 944
  • 0,8
  • 2

Эволюция криоэлектронной микроскопии воочию: изображение молекулы глутаматдегидрогеназы, полученное до 2013 года (слева) и после 2013 года (справа).

Автор
Редакторы

Доброй традицией Нобелевского комитета становится признание значимости методик, позволяющих «разглядеть» отдельные атомы: в 2014 году отметили сверхразрешающую микроскопию, а 4 октября 2017 года Нобелевскую премию по химии присудили «за разработку метода криоэлектронной микроскопии». Лауреатами стали трое исследователей: Жак Дюбоше из Университета Лозанны, Йохим Франк из Колумбийского университета в Нью-Йорке и Ричард Хендерсон из Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже. Заморозка биомолекул в движении позволяет получать их изображения в высоком разрешении, а методики компьютерной реконструкции дают пространственную структуру с точностью до атома. Исследование, начатое еще в 1970-е годы, все лучше и лучше позволяет оценивать архитектуру биоорганических комплексов.

Люди, регулярно читающие статьи в топовых научных журналах, давно уже привыкли к многочисленным молекулярным изображениям. Но микроскопы не позволяют увидеть отдельные молекулы [1]. Правда, существует микроскопия сверхразрешения, за которую в 2014 году дали Нобелевскую премию по химии [2], но и она не позволяет «разглядеть» отдельные атомы. Изучать строение биологических молекул с такой подробностью — удел структурной биологии [3], лидирующими методиками которой до недавнего времени считались рентгеноструктурный анализ (РСА) и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Интересным методом также является атомно-силовая микроскопия [4], но герой нашего сегодняшнего рассказа другой: это криоэлектронная микроскопия, за разработку которой вручена Нобелевская премия по химии уже этого, 2017 года [5].

Визуализация сложных структур, прежде считавшихся «невидимыми» ввиду их малых размеров, позволила совершить множество фундаментальных прорывов. Один из них — прогресс в борьбе с вирусом Зика [6], [7] (рис. 1), недавно вызвавшим пандемию одноименной болезни. Благодаря криоэлектронной микроскопии, в последние пять лет все более прочно входящей в «большую тройку» методов структурной биологии, удалось получить трехмерную модель этого коварного агента. Что, в свою очередь, положило начало поиску потенциальных мишеней для лекарственных веществ, способных справиться с болезнью.

Рисунок 1. Примеры некоторых белковых комплексов. а — Белковый комплекс, регулирующий циркадный ритм. б — Комплекс звукового сенсора уха, считывающий изменения давления и позволяющий нам слышать. в — Модель вируса Зика.

Краткий экскурс в историю микроскопии до 1975 года

Всю первую половину 20 века три самых известных биологических структуры — ДНК, РНК и белок — оставались белым пятном на карте биохимического мира. Было известно, что они есть в организме и играют важную роль в жизни клеток, но каково их строение — никто не имел ни малейшего понятия. Лишь в начале 1950-х годов знаменитая группа ученых из Кембриджа, включавшая Френсиса Крика, Джеймса Уотсона, Мориса Уилкинса и Розалинд Франклин, впервые попробовала облучать ДНК рентгеновскими лучами, что привело к открытию прославленной двойной спирали.

К кристаллографам относился поначалу и Ричард Хендерсон, получивший за свои ранние исследования пусть не Нобелевскую премию, но докторскую степень. Метод рентгеноструктурного анализа заключается в дифракции рентгеновских лучей на кристаллической решетке, что помогает идентифицировать структуру молекулы. Но в то время он был еще далек от совершенства, хотя сегодня это один из основных способов изучения структуры вещества [8]. Шагнув на 30 лет вперед, мы узнаем, что наука получила еще один способ расшифровывать строение биомолекул: в 1980-х годах для изучения структуры и динамики белков в растворе начали применять метод ядерного магнитного резонанса (и применяют до сих пор [9]).

Благодаря этим двум методам удалось накопить внушительные объемы информации по строению биологических молекул: на сегодня в базе PDB находится более 100 тыс. структур. Но, как это часто бывает, и у того, и у другого метода есть свои недостатки. Так, с помощью ЯМР можно визуализировать только белки, находящиеся в растворе, и размер их должен быть небольшим. А минус рентгеновской кристаллографии считывается в названии метода: он работает на стабильных структурах типа кристаллов, но не на динамических «живых» молекулах. Изображения, полученные с помощью этого метода, напоминают снимки первых в истории фотокамер: черно-белые и застывшие, не несущие в себе информации о подвижной структуре белка. Эта проблема заставила Ричарда Хендерсона бросить рентгеновскую кристаллографию в 1970-х, что и стало отправной точкой на его пути к Нобелевской премии 2017 года.

Шаг первый: бактериородопсин под прицелом электронного пучка

Хендерсона с самого начала интересовали мембранные белки. Почему же их визуализация оказалась неподвластна рентгеновскому методу на тот момент? Неудачи возникали при попытках кристаллизовать белок, тем самым нарушая его естественное состояние в липидной мембране клетки. Мембранные белки крайне трудно извлекать из мембраны, не нарушая их нативного состояния [10]: очень часто они просто «слипаются» в единую массу, неподвластную дальнейшему изучению. Впрочем, сейчас и в кристаллизации мембранных белков есть большой прогресс: мембрану просто научились делать частью кристалла [11].

После ряда неудачных попыток Ричард Хендерсон обратился к единственному, казалось, реальному варианту: электронной микроскопии. В чем принципиальное отличие электронного микроскопа от оптического? В просвечивающей электронной микроскопии (так называется эта техника) вместо пучка света к образцу посылается луч электронов. Длина волны электронов намного меньше, чем длина волны света, поэтому с помощью электронного микроскопа можно визуализировать даже очень маленькие структуры — вплоть до уровня отдельных атомов.

Читать еще:  Инструктор с синдромом Дауна: в 7 лет она скачивала танцы из интернета

В теории электронный микроскоп идеально подходил для исследований Ричарда Хендерсона — ведь он позволял получить изображения мембранных белков на атомном уровне. Но на практике эта идея казалась нереальной. Со времен изобретения электронного микроскопа считалось, что с помощью этого метода можно изучать исключительно неживую материю. Виной тому электронный пучок: он позволяет получать картинки с высоким разрешением, но фактически «сжигает» на своем пути живые структуры. Если же снизить его интенсивность, то изображение теряет контраст и получается нечетким.

Дополнительной преградой на пути визуализации биомолекул под электронным микроскопом является необходимость создания вакуума. При выкачивании воздуха из биологического образца испаряется и вода, обволакивающая живые структуры, из-за чего они теряют свою естественную форму. Таким образом, все обстоятельства выступали против Хендерсона. Однако его идею спас особый белок, обладающий исключительной стабильностью в мембране — бактериородопсин.

Бактериородопсин — светочувствительный белок, встроенный в мембрану некоторых архей. В какой-то мере его можно считать прототипом зрительного родопсина — фоторецептора нашей сетчатки [12]. Поглощая фотон, этот белок меняет конформацию, прокачивая внутрь цитоплазмы протон. Благодаря этому энергия солнечного света преобразуется в энергию разности электрических потенциалов на мембране, а затем запасается в виде энергии химических связей АТФ. Получается, что археи, подобно растениям, осуществляют фотосинтез.

Именно бактериородопсин был выбран в качестве «подопытного» объекта для исследования под электронным микроскопом. Но, в отличие от предшествующих попыток визуализации, Ричард Хендерсон с коллегами поместил под электронный пучок не экстракт белковой массы, а целый участок бактериальной мембраны. Белки, встроенные в привычную липидную среду, сохранили свою структуру. Кроме прочего, молекулы бактериородопсина образуют в мембране как бы «двумерный кристалл», создавая практически идеальные условия для изучения рентгеновской дифракции. Во избежание высыхания в вакууме исследователи зафиксировали мембранный материал в растворе глюкозы.

Конечно, «смертоносный» электронный луч все еще составлял проблему для исследования белка, даже под защитой мембранной упаковки. Уйти от этой помехи удалось, ослабив интенсивность пучка электронов, пропускаемых через образец. Правда, контраст изображения тоже был слабее, и отдельные молекулы были неразличимы наблюдателем. Но исследователи проанализировали дифракцию электронных лучей на белке, использовав те же принципы математического расчета, что и при рентгеноструктурном. Ученые поместили мембрану со встроенным в нее бактериородопсином под электронный микроскоп, проводя съемку с разных ракурсов. Так в 1975 году впервые удалось создать примерную трехмерную модель бактериородопсина. Этот результат стал лучшим из когда-либо созданных с помощью электронного микроскопа, но все же недостаточно впечатлил Хендерсона. Он был уверен, что электронная микроскопия способна давать гораздо большее разрешение, сравнимое с рентгеноструктурным.

В следующие несколько лет методы электронной микроскопии удалось значительно улучшить. Впервые появилась криотехнология, позволяющая исследовать образцы, охлажденные в жидком азоте, что защищало их от повреждений пучком электронов. Наконец, в 1990 году, спустя 15 лет после первой визуализации бактериородопсина, Ричарду Хендерсону удалось достигнуть своей цели: он презентовал структурную модель белка при атомном разрешении (рис. 2).

Рисунок 2. Эволюция модели бактериородопсина, пройденная за 15 лет. а — Первая «грубая» модель, опубликованная в Nature в 1975 году [13]. б — Усовершенствованная модель, сделанная в 1990 году [14].

Благодаря работе Ричарда Хендерсона удалось показать, что криоэлектронная микроскопия позволяет получать изображения структуры белковых комплексов в высоком разрешении. Но как быть с белками, которые не столь идеально упорядочены, как бактериородопсин? В том же 1975 году американский ученый Йоахим Франк начал работать в этом направлении.

Шаг второй: создание одной 3D-картинки из множества 2D-изображений

Стратегия Франка основана на компьютерном анализе зашумленного изображения с распознаванием отдельных молекул белка, хаотично расположенных в мембране. Ученый разработал математический метод, благодаря которому компьютер идентифицировал на изображении молекулы в различных ракурсах и объединял их единую базу [15]. Следующий шаг — построение одной трехмерной картинки на основе множества двумерных (рис. 3). Объектом, выбранным Франком для визуализации, стала рибосома — молекулярная «машина», собирающая в клетке белки.

Рисунок 3. Сборка одной трехмерной картинки из множества двухмерных по методу Франка.

Шаг третий: «остекленение» биоструктур в жидком азоте

Пока Ричард Хендерсон получал первые «фотографии» бактериородопсина, а Йоахим Франк разрабатывал математическую модель 3D-реконструкции белков из этих «фоток», другой ученый — Жак Дюбоше из Европейской молекулярно-биологической лаборатории в Гейдельберге — решал проблему «обезвоживания» биологических образцов в вакууме.

Ранее Хендерсон предложил технику фиксации образцов белков в мембране раствором глюкозы, однако такой способ не работал с молекулами, растворимыми в воде. Жак Дюбоше предложил изящное решение: предельно быстрое охлаждение воды, позволяющее ей перейти в аморфное твердое состояние, минуя стадию образования кристаллов льда — это называют витрификацией [16]. В «остекленевшей» капле воды пучок электронов рассеивается равномерно с созданием однородного фона, в котором находятся биологические молекулы. Первые опыты по криоэлектронной микроскопии были проведены с различными вирусами. Образцы помещали в воду, а затем этот раствор равномерно распределяли по металлической сетке с мелкими ячейками. Такую конструкцию замораживали в этане, охлажденном в жидком азоте, после чего образец был готов для визуализации (рис. 4). Наконец, в 1984 году Жак Дюбоше впервые опубликовал изображения вирусов разной формы, хорошо контрастирующих на прозрачном фоне остекленевшей воды (рис. 5) [17].

Рисунок 4. Метод заморозки биологических образцов по Дюбоше.

Рисунок 5. Первые микрофотографии вирусов, полученные с использованием метода Дюбоше.

В 1991 году Йоахим Франк «заморозил» рибосомы по методу Дюбоше, получив на выходе изображение их трехмерной структуры. И, несмотря на то, что картинка была сделана в небывалом для электронной микроскопии разрешении, исследователям удалось показать лишь очертания рибосомы. Странные каплевидные структуры все еще не выдерживали сравнения с атомным разрешением рентгеновской кристаллографии. Криоэлектронная микроскопия позволяла визуализировать лишь неверные контуры электронной плотности, напоминающие пузыри, из-за чего этот метод в шутку называли «блобология» (blobology) [18]. Но прогресс идет вперед, и после 2010 года получил распространение новый тип электронного детектора — Direct Electron Detector, позволяющий получать гораздо более детальное изображение биологических структур [19].

Читать еще:  Юлия Самойлова: Не у каждого есть силы, чтобы воспитать дух

Сегодня криоэлектронная микроскопия позволяет «ловить» биологические структуры «в динамике» на разных этапах. Совмещая полученные снимки, исследователям удается создавать целые фильмы, демонстрирующие перемещения и взаимодействия белков с другими молекулами. За последние пять лет чуть ли не каждая вторая молекулярная структура, опубликованная в журналах уровня Science и Nature, криомикроскопическая: это и новые состояния рибосомы [20], и АТФазы [21], и различные рецепторы [22], [23] и филаменты загадочного тау-пептида [24], и инфламмосома [25], и термочувствительный ионный канал TRPV1 [26], и многое другое. И это только начало: ученым еще предстоит определить точную структуру и механизм работы множества белков и других сложных биологических структур.

Криоэлектронная микроскопия: за что вручили Нобелевку по химии

МОСКВА, 4 окт — РИА Новости, Анна Урманцева. Нобелевская премия по химии-2017 присуждена швейцарцу Жаку Дебуши, американцу Йоахиму Франку и представителю Великобритании Ричарду Хендерсону за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры молекул с высоким разрешением в растворе, так как разработанный ими метод открывает новые возможности в изучении структур белков.

Несмотря на то что первый электронный микроскоп был построен в 30-х годах ХХ века, — и это было настоящим прорывом, поскольку прибор позволял получать изображение объектов с максимальным увеличением до 106 раз, стало понятно, что далеко не все интересные объекты можно с легкостью рассмотреть, ведь для этого их надо было погрузить в вакуум. В СССР данной проблемой занимался член-корреспондент АН СССР, биофизик Николай Киселев, работавший в Институте кристаллографии им. А. В. Шубникова.

Стало ясно, что работы с мелкими объектами, например белками, их необходимо специально обработать. Тогда и был найден метод покрытия их специальным раствором солей тяжелых металлов, под действием которых образец высыхал, а дальше с ним можно было делать что угодно.
Но что значит «посыпать солью» на микроуровне? То же самое, что и на макро. Вся поверхность белка покрывается своеобразным «снегом», что не дает возможности рассмотреть сам белок.

В дальнейшем белки научились кристаллизовать, однако выяснилось, что далеко не все молекулы поддаются кристаллизации. Если взять, например, белки, которые находятся в цитоплазме, то есть в растворенном состоянии, они кристаллизуются хорошо. А вот те, что «сидят» в мембранах клеток, просто разваливаются, если убрать «стенки», то есть мембраны. Поэтому ученые не могли изучить ни одну мембрану, а ведь из них состоят клетки любого живого существа, начиная с бактерий и заканчивая человеком.

Предложенный Жаком Дебуши новый метод криомикроскопии стал большим шагом вперед, а Йоахим Франк и Ричард Хендерсон доработали его. Теперь криомикроскопия проводится так: сначала изучаемый белок помещают в раствор, например в знакомый всем физраствор, который часто применяется в больницах для восстановления у пациента нужного количества внеклеточной жидкости.

Белок в физрастворе устанавливают в специальный витробот — аппарат, где созданы условия для витрификации, то есть перехода жидкости при понижении температуры в стеклообразное состояние. Аппарат изготавливает витрифицированный лед, через который можно наблюдать белок (обычный кристаллический лед для этого не подходит, поскольку меняет структуру белка).

Потом образец падает в газ этан (Ethanum), C2H6, который находится в сжиженном состоянии и представляет из себя жидкость с хорошей теплопроводностью. Тонкие прослойки «буфера» замораживаются (витрифицируются), превращаясь в идеальный лед: абсолютно ровный и с упорядоченным расположением молекул воды. В этом состоянии очень удобно рассматривать белки, которые черным цветом выделяются на фоне серого льда.

С разработкой метода Жака Дебуши, Йоахима Франка и Ричарда Хендерсона появилась возможность анализа структуры белков, которые с трудом поддаются кристаллизации, — ионные каналы, молекулярные машины, вирусы. Это ведет к настоящему прорыву в создании лекарств.

Поясняет доктор биологических наук, профессор РАН, доцент биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова Ольга Соколова: «Я была уверена, что в этом году Нобелевскую премию по химии дадут Жаку Дебуши, Йоахиму Франку и Ричарду Хендерсону, так и получилось. Еще одно мое предсказание состоит в том, что наш университет не обойдется без современного криоэлектронного микроскопа, поддерживающего эту прорывную технологию для изучения структур белков и других электроннопрозрачных объектов. Очень надеюсь, что скоро мы сможем приступить к изучению структур ионных каналов, теломеразы, транскрипционных комплексов, которые научились получать в очищенном виде на разных факультетах МГУ, используя именно этот метод.»

Нобелевская премия по химии 2017. Разработка криоэлектронной микроскопии

Нобелевскую премию по химии в этом году получили Жак Дюбоше, Иоким Франк и Ричард Хендерсон за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры молекул с высоким разрешением в растворе. Это событие прокомментировала доктор биологических наук, руководитель группы микроскопических исследований Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, профессор Елена Ивановна Рябчикова

Нобелевский комитет по химии утверждает, что «метод криоэлектронной микроскопии перевел биохимию в новую эру» – это цитата с церемонии. Бесспорно, этот метод открыл для ученых новые возможности, он мощный и прорывной. Для многих решение Нобелевского комитета по химии выглядит несколько странным, все-таки химия – наука о веществах и их применении. С другой стороны, неплохо отметить развитие метода, который, действительно позволяет исследовать структуру макромолекул и других биологических объектов в нативном состоянии. Не нужно думать, что криоэлектронная микроскопия – только микроскоп. Прежде всего, это – комплекс сложных и дорогостоящих процедур подготовки образцов, требующий высокой квалификации исследователя. Три нобелевских лауреата, Жак Дюбоше, Иоким Франк и Ричард Хендерсон внесли свой вклад в совершенствование метода.

Читать еще:  Протоиерей Николай Соколов: О роли мирян в Церкви

Человечество всегда стремилось разглядеть окружающий мир лучше. Вся микроскопия базируется на линзах Левенгука и оптической системе микроскопов Гука, созданных в XVII в. Микроскоп Левенгука позволил ему открыть мир микроорганизмов, а микроскоп Гука – клетки. Позже появилась световая микроскопия, где объекты освещались при помощи лампы, и относительно недавно – электронная микроскопия.

Электронная микроскопия стала необходимым инструментом ученых, работающих в разных областях, в том числе биологов. Но в электронном микроскопе нельзя изучать клетки и другие объекты без предварительной обработки, поскольку образец подвергается действию пучка электронов, вакуума и высоких температур. Предварительная обработка, несомненно, влияет на тонкую структуру, и перед исследователями стояла задача разработать метод изучения объектов в нативном состоянии. Метод замороженных срезов, используемый в световой микроскопии, был одной из основ разработки аналогичного метода для электронной микроскопии. Суть криоэлектронной микроскопии – изучение в электронном микроскопе замороженных образцов. Воздействие высокой температуры в криоэлектронном микроскопе нивелировали охлаждением образца жидким азотом, а вот проблема кристаллизации воды при замораживании потребовала отдельного решения.

Кристаллы воды повреждали структуру образца, и Жак Дюбоше в 80-х годах предложил использовать быстрое охлаждение воды, чтобы она, минуя фазу кристаллизации, переходила в стеклообразное (витрифицированное) состояние. Такая вода не только предохраняет образец от разрушения в вакууме, но и не рассеивает электроны.

Второй лауреат, Иоахим Франк, в 1980-х г. разработал метод построения трехмерных структур изучаемых объектов на основе обработки полученных с помощью электронного микроскопа двумерных изображений – электронно-микроскопическую томографию. Этот метод применяется не только для анализа биологических объектов, но и в других областях науки.

Третий лауреат, Ричард Хендерсон, в 1990 г. первым получил с помощью криоэлектронного микроскопа трехмерное изображение белка родопсина с разрешением на атомарном уровне. Для того времени – большое достижение, в настоящее время опубликованы реконструкции множества белков. Особую ценность криэлектронная томография имеет для понимания строения белков сложной формы, в первую очередь – мембранных, которые нельзя изучать методом рентгеноструктурного анализа.

Криоэлектронная микроскопия отражает комплекс технических и теоретических разработок и, несомненно, является одним из самых передовых методов клеточной и молекулярной биологии. Приборная база этого метода совершенствуется и требует высокой квалификации исследователей, а также постановки адекватных задач.

Заморозить и рассмотреть

Эксперты в самой Швеции предсказывали победу дуэту француженки и американца за технологию в области генной инженерии — что-то вроде «ножниц ДНК», которыми можно «чинить гены». В который раз называли претендентами разработчиков литий-ионных аккумуляторов — они, как известно, уже широко используются в сотовых телефонах, фотоаппаратах, ноутбуках и планшетах.

Но как ни старались PR-компании и брендовые информагентства представить-засветить по удобному случаю своих ученых клиентов, в очередной раз попали пальцем в небо.

Лавры лауреатов достались нынче англичанину, американцу и гражданину Швейцарии. Это Ричард Хендерсон (Великобритания), Йоахим Франк (США) и швейцарец Жак Дебуши. Как объявил в среду в Стокгольме специальный Нобелевский комитет Королевской академии наук Швеции, «награда присуждена за разработку криоэлектронной микроскопии для определения структуры молекул с высоким разрешением в растворе». За этой формулировкой сравнительно новый метод электронной микроскопии, при котором образец исследуют при очень низких температурах. Как объясняют сами ученые, метод крио-ЭМ наиболее востребован в структурной биологии, потому что «позволяет наблюдать за образцами в их естественной среде». И это выгодно отличает его от рентгеновской кристаллографии, при которой требуется кристаллизация образца или помещение его в нефизиологическую среду. При исследовании биообъектов это во многих случаях неприемлемо.

Насколько развит новый метод в России? В ответ на схожий вопрос в Институте физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского (входит в структуру МГУ) посетовали, что метод дорогой и у нас доступен лишь избранным. «В Европе и Америке каждый уважающий себя университет обзаводится таким оборудованием, а у нас несколько штук на всю страну», — заявил корреспонденту ТАСС завотделом электронной микроскопии этого НИИ Игорь Киреев. По его словам, два прибора, которые могут это делать, есть в НИЦ «Курчатовский институт», но их явно недостаточно. Завлабораторией электронной микроскопии в самом Курчатовском центре Александр Васильев подтвердил, что метод, за который дали Нобелевскую премию, «находится на острие науки» и «позволяет много чего получить — структуры белков, вирусов, макромолекул».

Это достигается, в частности, за счет сверхбыстрого замораживания. Исследуемые образцы в результате стабилизируются и, как объяснил Игорь Киреев, остаются в водной среде, как будто бы они внутри клетки. Но в то же время становятся твердыми, что позволяет, если речь идет о тканях или клетках, изготовить срезы для электронного микроскопа.

Как отметили в Нобелевском комитете, криоэлектронная микроскопия позволяет заполнить множество пробелов в «карте биохимии». Теперь ученые могут заморозить биомолекулы во время движения и визуализировать процессы, которые прежде никогда не могли наблюдать. Подчеркивается, что открытие имеет решающее значение для базового понимания химии жизни и развития фармацевтики.

Отныне в списке лауреатов премии по химии 177 ученых, в том числе четыре женщины. В 1911 году награды была удостоена Мария Кюри (за открытие радия и полония), а в 1935 году за синтез новых радиоактивных элементов Нобеля по химии получила ее дочь Ирэн Жолио-Кюри вместе с мужем Фредериком Жолио. Британский биохимик Фредерик Сэнгер этой премии удостоен дважды — в 1958 году и в 1980-м.

Для нашей страны такой праздник случился лишь раз — в 1956 году академик Николай Семенов разделил награду за исследование механизма химических реакций с англичанином Сирилом Хиншелвудом.

Ссылка на основную публикацию
Статьи c упоминанием слов:

Adblock
detector